熒光定量 PCR檢測服務
一、 miRNA qPCR 技術服務項目
   1. 根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針
   2. 抽提DNA/RNA，逆轉錄RT-PCR及cDNA擴增
   3. eal-TimePCR(熒光定量PCR)，進行實驗結果分析  
   4.特色項目
     a、特殊物種（除人、大鼠及小鼠外）miRNA特異性引物設計（SYBR Green染料法）。本公司設計提供特異性的莖環引物，相較于傳統的Olig-dT引物，結果準確率更高。
     b、miRNA 差異性表達數據分析（包括提供t-test結果、實驗步驟、擴增曲線圖、溶解曲線圖、差異表達分析圖及原始數據）。
 熒光定量 PCR檢測服務
二、 miRNA qPCR 技術服務流程
   1. 樣品RNA準備
   提供樣品總RNA，也可提供組織、血液、細胞類樣品，需支付樣品的前期處理費用。
   2. RNA質量檢測
   紫外吸收測定法測定波長260nm和280nm的吸收值，判斷RNA樣品的濃度。
   3. 逆轉錄合成cDNA
   利用莖凸環引物逆轉錄合成cDNA鏈。
   4. 實時熒光定量PCR
   以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增（每個樣品檢測三次，同時檢測每個樣品中U6 snRNA或5S rRNA含量作為內參，以校正上樣誤差）。
   5. 分析結果、提供實驗報告
   相對定量—分析相對表達參數，提供統計學分析，獲得相對表達差異；
定量—依據miRNA標準品制作標準曲線（每條曲線上至少設置5個數據點），以定量樣品中的待檢測miRNA；
分析實時定量PCR結果，提供實時定量PCR實驗數據和擴增曲線，融解曲線，柱狀圖。

 
三、miRNA qPCR技術服務樣品提供
   a. RNA樣品：取10µg總RNA，并提供RNA質量檢測圖。要求濃度在500ng/µl以上，體積在20µl以上，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之間，電泳檢測28s的亮度約為18s的兩倍。-80℃貯存，干冰運輸。
   b. 組織樣品：請將200mg以上的組織樣本，并分裝為兩管。-80℃或者液氮貯存，干冰運輸。
   c. 血液樣品：請提供至少2mL血樣，并在2小時內處理完畢后加入Trizol。
     全血：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，按每200µl全血加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃箱保存，干冰運輸。
     血漿：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，4℃ 4000rpm離心5分鐘，上層為血漿樣本，按每200µl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸。
     血清：用非抗凝管收集血樣，靜置分離上層血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸。
  d. 細胞樣品：
    貼壁細胞
   （1） 貼壁細胞培養或處理結束后，去除培養液；
   （2） 按每10 cm2 培養面積加1 mL Trizol試劑的比例加入Trizol試劑；搖勻，細胞接觸到Trizol而被充分消化；
   （3） 用1 ml槍頭反復吹打, 并將Trizol細胞懸液轉移至RNAase-free 的EP管中；
   （4） 放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰運輸。
   懸浮細胞
   （1） 懸浮細胞培養或處理結束后，離心去除培養液；
   （2） 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；
   （3） 按照每5×106 個細胞加1 mL Trizol的比例加入Trizol試劑，渦旋振蕩使細胞充分懸浮；
   （4） 放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰運輸。